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  • CRISPR应用指南:选择哪一种Cas9?[选购宝典]

    【字体: 时间:2016年03月01日 来源:生物通

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      CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰,能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过,目前有这么多种Cas9可供选择,你一定又开始犯愁。别急,让Addgene的专家来帮帮你。

    CRISPR/Cas9的出现使得人们能够高效地开展精确而靶向的基因组修饰。这其中的关键组分Cas9经过修饰,能够敲除、活化、抑制甚至是成像你感兴趣的基因。不过,目前有这么多种Cas9可供选择,你一定又开始犯愁。别急,让Addgene的专家来帮帮你。

    首先,让我们来想想实验的目的吧。你希望永久敲除一个基因,还是希望降低特定基因的表达,而并非永久性地修饰基因组?激活特定位点是不是更有意义?还是,修饰表观基因组?这些问题的答案将决定了你的实验需要哪种Cas9。

    基因敲除选哪个?

    标准的SpCas9

    通过共表达目的基因特异的gRNA和核酸内切酶Cas9可创建敲除的细胞或动物?;蜃槟勘昕杀蝗魏蝵20个核苷酸的DNA序列靶定,前提是它满足两个条件:1) 序列在基因组中是独特的;2) 目标在间隔相邻基序(PAM)的上游。当基因组中有适合的目标位点,并且不太在意脱靶效应时,SpCas9是合适的选择。

    关心特异性?

    设计适当的gRNA序列,能增强Cas9介导的切割的特异性。不过,人们也利用多种方法来进一步增强Cas9的特异性。例如,Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH来产生双链断裂,Cas9-nickase(Cas9n)就利用了这一点。它将两个关键残基中的一个转换成丙氨酸(D10A或H840A),形成了Cas9切刻酶。目标位点上需要两个正确识别的Cas9n分子,才能产生双链断裂,这与野生型SpCas9相比大大增强了特异性。

    尽管Cas9n无疑比SpCas9更加特异,但它仍然可能与脱靶位点结合,导致插入缺失。为了克服这个限制,人们使用失去核酸酶活性的Cas9(dCas9),将其与非特异性的内切核酸酶FokI融合。FokI只在二聚化时切割目标DNA。因此,只有当两条dCas9-FokI分子正确靶定目标序列,切割才会发生。

    Cas9n或dCas9-FokI方法的一个明显局限在于它们都需要两个适当的目标序列足够靠近,才能有效地产生双链断裂。一些实验室则利用结构生物学来鉴定Cas9切割脱靶位点的关键残基,包括Broad研究院的张锋实验室和麻省总医院的Keith Joung团队。与野生型的SpCas9相比,“增强型Cas9”(张锋)或“高保真Cas9”(Joung)的切割活性相当,但脱靶活性大大降低。

    基因活化选哪个?

    Cas9的独特之处在于它结合DNA的能力和切割DNA的能力是独立的?;痪浠八?,即使切割DNA的能力被破坏掉,它仍然能够与目标DNA结合。此外,失去核酸酶活性的Cas9(dCas9)可作为一个平台,向特定的DNA位点带去不同的货物。这种特性把各种蛋白带给目的基因,包括转录激活因子和抑制因子。


    抑制目的基因

    早期使用dCas9的实验已表明,让dCas9针对转录起始位点就足以“压制”转录。不过,在哺乳动物的细胞中,需要让带有转录抑制因子的dCas9靶定目的基因的启动子区域,才能实现可靠的抑制。如果目的基因的敲除对细胞有毒性,那么你可能需要考虑基于dCas9的抑制,包括dCas9-KRAB。Addgene提供多种质粒,抑制各个物种和细胞类型中的目的基因。

    活化目的基因

    基于dCas9的激活因子却是完全不同的。最简单的激活因子是指dCas9与单个转录激活域(通常是VP64)相融合。最近,第二代的激活因子也被开发出来,利用不同的方法改变基因表达。例如,“SunTag”系统通过dCas9和抗体活化融合蛋白的共表达,将多个激活域招募到同一个基因位点。Synergistic Activation Mediator复合物则包含dCas9-VP64融合和修饰的gRNA,后者能够与其他的RNA-结合转录激活因子相互作用。

    下一步做什么?

    如果你已经选择了适当的Cas9,恭喜你!下一步做什么呢?这里有一些注意事项,也许对你的CRISPR实验有帮助。

    设计或选择一个gRNA – 对于你感兴趣的目的基因,一些公司提供了经过验证的gRNA。这些gRNA已经成功应用在实验中,并发表在同行评审的期刊上,在你刚开始着手CRISPR实验时,它们能节省不少的时间和成本。如果你的实验需要新的gRNA,那么可以选择空的gRNA载体,并利用免费的gRNA设计程序设计你的gRNA靶向序列。

    不过,选择适当的Cas9只是实验成功的一半,你还需要选择适当的表达系统,并将Cas9导入目的细胞。目前市场上有各种含Cas9的质粒,可用于不同物种的表达,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物等。对于难转染的细胞,你可能需要考虑用慢病毒将Cas9导入细胞内。当然,导入mRNA和蛋白质也是另一种选择。

    验证你的基因组编辑 – 一旦将Cas9和gRNA导入细胞,现在是时候确认你的目标序列是否得到了修饰。具体操作可能有所不同,这取决于特定的实验。之后我们会详细介绍。(生物通 薄荷)

     

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