• 面膜混搭保养法 满足肌肤的不同需要 2019-06-20
  • 政府可以处变不惊,但一些企业、股民却成了惊弓之鸟。 2019-06-20
  • 孙佩苍旧藏吴作人留欧大作《坐女人像》现西泠春拍 2019-06-20
  • 【“健”识早知道】“垃圾睡眠”比失眠还可怕?四招助你一夜好眠! 2019-06-17
  • 打工小伙捡到“宝贝,专家估值上亿,权威教授现场却犯了难? 2019-06-16
  • 中国石油呼和浩特石化公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-06-16
  • 人民日报人民时评:个人信息,利用好更需保护好 2019-06-14
  • FONT color=red公告:有不法分子冒充举报中心工作人员行骗FONT 2019-06-14
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-06-12
  • 华晨宝马召回共计2001辆530Le 管路装配存在缺陷 2019-06-12
  • 热带雨林旅行地中国国家地理网 2019-06-11
  • 聚焦总目标不折不扣贯彻党中央治疆方略 2019-06-10
  • 2018年军队院校报考指南 军校在山西省计划招生396人 2019-06-10
  • 端午话诗词,感悟习近平眼中的优秀传统文化 2019-06-05
  • 湖北保险业启动空中公益救援 2019-06-05
  • 光遗传学+CRISPR:利用光来控制基因组编辑[创新技巧]

    【字体: 时间:2016年04月06日 来源:生物通

    时时彩包赢公式0369 www.dvl-c.com 编辑推荐:

      作为经常上头条的明星,光遗传学(optogenetics)和CRISPR这两个技术的碰撞会产生什么样的火花?2015年,科学家结合CRISPR和光遗传学技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。

    作为经常上头条的明星,光遗传学(optogenetics)和CRISPR这两个技术的碰撞会产生什么样的火花?2015年,科学家结合CRISPR和光遗传学技术,开发出各种光激活的CRISPR工具。这些工具让研究人员能够利用光从外部控制基因组编辑过程的地点、时机和可逆性。

    从时空上控制转录

    最初的光激活CRISPR系统于2015年年初发表,侧重于利用光来控制转录。两个独立的实验室,东京大学的Moritoshi Sato实验室和杜克大学的Charles Gersbach实验室,基于光诱导的异源二聚体隐花色素2(CRY2)和整合素结合蛋白1(CIB1),开发出相似的系统。他们的目标是利用光来开启和关闭基因的表达,同时赋予时空控制和可逆性。

    Nihongaki等人开发出的系统是由两个融合蛋白组成的:1) 基因组锚定物 – 失活的Cas9蛋白(dCas9)与CIB1融合;2) 激活物 – CRY2光裂合酶同源区域(CRY2PHR)与转录激活域(VP64或p65)融合。一旦在细胞中表达,在gRNA指引下,dCas9-CIB1与目标DNA序列结合,而CRY2PHR-激活物自由漂浮。在蓝光的照射下,CRY2和CIB1二聚化,带来激活物,激活基因转录。

    研究人员测试了多种组合来优化融合蛋白。他们发现,表现最好的组合是NLS-dCas9-trCIB1和NLSx3-CRYPHR-p65。在蓝光(470nm)的照射下采用狭缝模式,研究人员发现,人ASC1基因的表达可被空间控制。他们还不断开启和关闭蓝光,发现ASC1的表达也跟着做,说明控制的确是可逆且可重复的。

    Polstein等人开发的光激活CRISPR/Cas9效应物(LACE)系统也采用了相似的策略,不过采用了不同的融合蛋白组合。经过优化的LACE系统包括:1) CIBN-dCas9-CIBN,其中CIBN是CIB1的N端片段,与dCas9的N端和C端融合;2) CRY2FL-VP64,全长的CRY2与转录激活域VP64融合。在HEK293T细胞中利用此系统来诱导人IL1RN的表达,研究人员发现2小时后mRNA水平提高11倍,30小时后提高400倍。此系统也被证明是可逆的和可重复的。


    光活化的基因组修饰

    之后,Sato实验室又推出了光活化系统来切割目标DNA序列,它产生的双链断裂(DSB)可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来修复。这个系统的独特之处在于它利用了一种“分裂的”核酸酶。作者将Cas9分成N端(2-713个残基,N713)和C端(714-1368个残基,C714)。作者将每个Cas9片段与一个二聚化的结构域相融合,创建了光活化的Cas9工具。

    尽管作者尝试了几种不同的光活化设计,但他们最成功的设计是利用了磁性光控蛋白,来源于真菌感光体Vivid。这个新系统的昵称为paCas9-1,包含融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714,显示出低背景和高的诱导活性。与全长的Cas9相比,paCas9-1识别相同的PAM,并有着相似的定位特异性。在蓝光的激发下,paCas9-1能通过NHEJ诱导插入缺失(频率为20.5%),并通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。

    作者还表明,他们能够通过修改paCas9-1来降低系统的背景活性。他们用nMagC714来取代nMagHigh1-C714,生成了paCas9-2。这种改变并未明显改变系统生成突变的效率,但降低了背景DSB。与他们之前的工作一样,Sato实验室还表明paCas9-2可以在空间上控制,并通过蓝光开关来可逆激活。

    正如人们所期望的,Nihongaki等人证明,替换融合物中的Cas9结构域,也可以生成光活化的切口酶和抑制物(dCas9)。所有变异体的活性都是可逆且可重复的。

    罩住CRISPR

    此外,Alexander Deiters的实验室则采用了一种不同的方法来调控CRISPR。他们利用遗传编码的光罩(photocaging)技术,在Cas9蛋白上插入了一个可光去除的?;せ?,也就是硝基苯罩住的赖氨酸(PCK)。为了在Cas9的特定位点插入PCK,研究小组使用了吡咯赖氨酰tRNA合成酶,在到达琥珀终止密码子时加入PCK。

    研究人员首先检验了罩住Cas9的哪个赖氨酸能够让蛋白的切割能力更好地失活,发现是K866赖氨酸。然后,他们利用双报告基因荧光检测,证明Cas9 K866PCK突变体的确失活,而用紫外光(365nm)照射后,它显示出与野生型Cas9同样的切割活性。最后,研究人员证明,这种光罩Cas9系统能够让内源的基因表达沉默。

    如今,无论你想激活、抑制或修改基因,你身边都有工具,通过光来控制基因组编辑。随着CRISPR和光遗传学的发展,我们期待未来看到更多更酷的应用。(生物通 薄荷)

    我来说两句
    0  条评论    0 人次参与
    登录 注册发布
    最新评论刷新
    查看更多评论 > >

    订阅生物通快讯

    订阅快讯:

    最新文章

    限时促销

    会展信息

    关注订阅号/掌握最新资讯

    时时彩包赢公式0369 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 时时彩包赢公式0369 | 仪器龙虎榜

    版权所有 生物通

    Copyright© www.dvl-c.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号

  • 面膜混搭保养法 满足肌肤的不同需要 2019-06-20
  • 政府可以处变不惊,但一些企业、股民却成了惊弓之鸟。 2019-06-20
  • 孙佩苍旧藏吴作人留欧大作《坐女人像》现西泠春拍 2019-06-20
  • 【“健”识早知道】“垃圾睡眠”比失眠还可怕?四招助你一夜好眠! 2019-06-17
  • 打工小伙捡到“宝贝,专家估值上亿,权威教授现场却犯了难? 2019-06-16
  • 中国石油呼和浩特石化公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-06-16
  • 人民日报人民时评:个人信息,利用好更需保护好 2019-06-14
  • FONT color=red公告:有不法分子冒充举报中心工作人员行骗FONT 2019-06-14
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-06-12
  • 华晨宝马召回共计2001辆530Le 管路装配存在缺陷 2019-06-12
  • 热带雨林旅行地中国国家地理网 2019-06-11
  • 聚焦总目标不折不扣贯彻党中央治疆方略 2019-06-10
  • 2018年军队院校报考指南 军校在山西省计划招生396人 2019-06-10
  • 端午话诗词,感悟习近平眼中的优秀传统文化 2019-06-05
  • 湖北保险业启动空中公益救援 2019-06-05
  • 幸运赛车前三走势 必赢真人龙虎斗开户平台 3d开机号与试机号历史对应码 云南十一选五任四遗漏 北京单场技巧 河南11选5视频下载计划软件 福利彩票官网手机版 体彩6场半全场胜负玩法 内蒙古快三预测专家 福建十一选五基本走 江苏体彩十 彩票南粤36选7开奖结果 幸运赛车分析 3d087开组三还是组六 体彩p3图谜275期