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    【字体: 时间:2016年06月28日 来源:生物通

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      如今,人们通常利用新一代测序(NGS)技术对cfDNA进行高通量分析,看看哪些基因有突变,并根据突变信息来确定下一步的诊疗方案。从理论上说,这是一种简单易懂的方法,不过,血清或血浆中的cfDNA浓度极低,这为测序文库的制备带来了挑战。

    血清或血浆中的游离DNA(cfDNA)正成为无创产前检测(NIPT)或癌症液体活检的焦点。在癌症检测中,人们已发现癌症患者的cfDNA数量和完整性与健康对照不同。这使得cfDNA有望成为癌症诊断、预后和分层的生物标志物。

    如今,人们通常利用新一代测序(NGS)技术对cfDNA进行高通量分析,看看哪些基因有突变,并根据突变信息来确定下一步的诊疗方案。从理论上说,这是一种简单易懂的方法,不过,血清或血浆中的cfDNA浓度极低,这为测序文库的制备带来了挑战。

    为此,QIAGEN开发出一种经过优化的文库制备方案,融合了高效率的接头连接和无偏向的文库扩增,可确?;竦酶卟康挠胖什庑蛭目?,而只需要1 ng cfDNA。制备出的文库可与靶向富集技术相结合,实现灵敏的突变检测。

    流程改进

    cfDNA有两个明显的特征:首先,浓度极低,通常1 ml血浆中只能提取出1-100 ng cfDNA;其次,血浆或血清中的循环DNA大多以短片段存在,在180 bp左右。根据这些特征,GeneRead Library Prep Kit的操作进行了一些修改,省去了片段化的步骤。连接步骤中的接头浓度有所降低,并使用Agencourt AMPure XP纯化反应,去除接头二聚体。

    当然,在制备文库之前,你要先从人类血清或血浆中纯化出游离的DNA和RNA。很多文献都采用了QIAGEN的QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit。它利用硅胶膜选择性地结合目标核酸,可从血浆、血清和其他无细胞体液中高效纯化游离核酸。样品处理量可达5 ml,洗脱体积可在20–150 μl之间灵活选择。

    之后,利用10 μl cfDNA洗脱物,你就可以轻松地建库了。整个流程大约在3小时内完成,而手工操作时间不到30分钟。首先进行末端修复,加A尾,再连接接头。之后利用Agencourt AMPure XP纯化反应,去除接头二聚体。接着是12个循环的文库扩增,纯化后即可得到高质量的NGS文库啦。

    单管操作

    操作过程中需要使用到三个试剂盒:GeneRead DNA Library I Core Kit、GeneRead Adapters以及GeneRead DNA I Amp Kit。这些试剂盒与Illumina的仪器兼容。另外,QIAGEN也提供与Ion Torrent仪器兼容的试剂盒。不过,Agencourt AMPure XP磁珠需要单独购买。

    GeneRead DNA Library I Core Kit包含末端修复、加A尾和连接所需的缓冲液和试剂。与其他的文库制备流程相比,快速的单管操作只需较少的回收步骤,极大程度减少了手工操作可能带来的污染和失误风险,节省时间和人力。

    GeneRead DNA I Amp Kit含有创新的高保真预混液,其中包含用于扩增的GeneRead HiFi Polymerase。GeneRead HiFi Polymerase是独特的、高度特异性的聚合酶,能够准确扩增文库DNA,错配率低,序列偏差小。在标准的PCR扩增中,若DNA序列的AT或GC含量高,则扩增产物可能较少或没有,导致错误的序列数据或NGS测序结果。GeneRead HiFi Polymerase与预混液中独特的配方共同作用,能够确保均一扩增GC含量高的基因组序列,以便在后续的测序实验中获得准确结果。

    优质文库

    QIAGEN曾对文库质量进行评估,发现几乎100%的测序数据(reads)能定位到人类参考基因组,并且近100%是unique reads。高比例的unique reads代表了高的文库转换效率,也代表了文库中高的序列多样性。

    这种cfDNA测序文库与基于杂交的靶向富集相结合,也带来了出色的覆盖度。QIAGEN曾利用xGen® Pan-Cancer Panel,从文库中富集127个突变基因。测序后发现,超过99%的reads都以0.2X平均覆盖度覆盖,而超过90%的reads以0.5X平均覆盖度覆盖。不同位置的目标区域也有着极其相似的平均覆盖度。

    这下,你信心大增了吧。通过GeneRead文库制备的改良操作,即使是浓度极低的cfDNA,也能带来优质、高产的文库。(生物通 余亮)

    了解QIAGEN的cfDNA直接建库方案

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